مقاله بررسی میزان آدنوزین تری فسفات در اسپرم مولدین ماهی کفال در شرایط مختلف
مقاله بررسی میزان آدنوزین تری فسفات در اسپرم مولدین ماهی کفال در شرایط مختلف
| دسته بندی | شیلات |
| فرمت فایل | doc |
| حجم فایل | ۳۶۵ کیلو بایت |
| تعداد صفحات | ۲۲ |
دریافت فایل
مقاله بررسی میزان آدنوزین تری فسفات در اسپرم مولدین ماهی کفال در شرایط مختلف در ۲۲ صفحه ورد قابل ویرایش
چکیده:
کفال ماهیان دریای خزر یکی از مهمترین ماهیان شیلا تی این دریا می باشند که امروزه اکثریت صید ماهیان دریای مذکور به خود اختصاص داده اند.: هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی[۱] در شرایط زمانی، دمایی و تداوم بخش[۲]های مختلف بوده است.: بدین منظور میزان ATP اسپرم های:
۱) نمونه های تازه در دماهای مختلف ۱۰-۱۲ درجه و ۱۸-۲۰ درجه سانتی گراد،
۲) نمونه های نگهداری شده در دماهای مختلف۴ (درجه و دمای اتاق) به مدت شش ساعت،
۳) نمونه های نگهداری شده در ( تداوم بخش های مختلف ( گلیسرول، محلول نمک ۷/۰ %، محلول نمک ۶۵/۰%) به مدت ۵ و ۱۰ روز، به روش فوق حساس بیو- لومینوسانس اندازه گیری گردید.
بر اساس آزمایش های انجام شده در این تحقیق غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای ۱۰ تا ۱۲ درجه سانتیگراد ۲۲/۷ ±04/74% غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای ۱۸ تا ۲۰ درجه بود. اسپرم های نگهداری شده در دمای ۴ درجه و دمای آزمایشگاه به مدت ۶ ساعت به ترتیب ۹۱/۰ ±26/90% و ۴۹/۱ ±17/17% ATP خود را حفظ کردند.
نگهداری اسپرم در تداوم بخش های مختلف( گلیسرول، محلول نمک ۷/۰ %، محلول نمک ۶۵/۰% ) به مدت ۵ روز نشان داد که گلیسرول و محلول نمک ۶۵/۰% درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک ۷/۰% حفظ کردند و نگهداری اسپرم در همان تداوم بخش ها به مدت ۱۰ روز نشان داد که گلیسرول درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک ۷/۰% و ۶۵/۰% حفظ کرد.
براساس نتایج بدست آمده برای حفظ میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی نمونه گیری در دمای ۱۸-۲۰ درجه و نگهداری در گلیسرول توصیه می شود.
واژگان کلیدی: اسپرم، ماهی کفال طلایی، ATP،
مقدمه:
اسپرم به عنوان یک عامل مهم تولید مثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسی اسپرم از نظر پارامترهایی چون توانایی تلقیح، تحرک، درصد اسپرم های متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکی، میزان ATP و فاکتورهای شیمیایی و بیو شیمیایی، در تشخیص کیفیت اسپرم و کنترل روند تولید مثلی موجودات زنده از جمله آبزیان به ما کمک می کند. به همین علت تاکنون تحقیقات گسترده ایی توسط پژوهشگران مختلف روی این سلول صورت گرفته است. با این حال مطالعات انجام شده در ارتباط با میزان ATP اسپرم ماهیان نسبتا کم است. این امر تفسیر علت ناموفق بودن پروژه های پرورشی کردن برخی ماهیان را دشوار می کند. در این رابطه باید مطالعات بیشتری در زمینه بررسی میزان ATP اسپرم ماهیان صورت پذیرد. اسپرم به کمک حرکت ضربه ایی تاژک خود شنا می کند. انرژی مورد نیاز برای این حرکت از طریق هیدرولیزATP فراهم می شود.(۱).تحرک اسپرم به میزان ATP ذخیره ایی اولیه(۲) و میزان ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (۳) وابسته است. در اکثر ماهیانی که دارای لقاح خارجی هستند،ATP سنتاز قادر به نگهداری نسبت های بالای ATP هیدرولیز شده مورد نیاز در طول حرکت نیست لذا میزان ATP به سرعت کاهش می یابد. این کاهش ATP به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکی و سرعت حرکت اسپرم است(۲). یک رابطه خطی بین ظرفیت تلقیح اسپرم و پارامترهای اسپرمی از جمله میزان ATP و سرعت حرکت اسپرم وجود دارد(۴) آنزیم اصلی تبدیل انرژی شیمیایی گرادیان پروتون در سیستم بیولوژیکی ، ATP سنتتاز است. این آنزیم برای سنتز ATP از ADP و فسفات غیرآلی استفاده می کند ساختمان و عملکرد این آنزیم در گونه های مختلف یکسان است (۵) تفاوت قابل توجهی بین گونه ها در مقدار ATPمورد نیاز برای تامین حرکت اسپرم وجود دارد(۶). تحقیقی در رابطه با میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی تاکنون صورت نگرفته است. در این پروژه سعی بر آن داشتیم که میزانATP اسپرم ماهی کفال طلایی را در شرایط مختلف اندازه گیری نماییم.
مواد و روشها:
به منظور بیان میزان ATP برحسب تعداد سلول ، تعداد اسپرم های موجود در یک میلی لیتر از مایع اسپرم اخذ شده از ۱۰ ماهی نر کفال طلایی ، به کمک لام نئوبار و میکروسکوپ نوری (NIKON Y100) مورد شمارش قرار گرفت. در این تحقیق جهت بررسی تاثیر دمای نمونه گیری و میزان ATP اسپرم ماهی ، نمونه گیری در دو دمای ?C 10-12 و۱۸-۲۰ ?C انجام شد . ما در این تحقیق برای اندازه گیری میزان ATP از روش بیولومینوسانس استفاده کردیم بدین شکل که نمونه اسپرم را به نسبت ۱۰۰/۱ در محلول بافر HEPES جوشان مخلوط کرده سپس ۵۰ از آن را با ۵۰ از محلول کیت حساس بیولومینو سانس (Biaffin) در پلیت مخصوص اندازه گیری لومینوسانس با هم مخلوط کرده و سینگالهای لومینوسانس را با استفاده از دستگاه لومینومتر
۱۰-۱۹ mol/well Germany) × (Lumistar BMG labtech GmbH 5اندازه گیری کرده و سپس میزان ATP هرنمونه را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه کرده و بصورت nmol/108 اسپرم بیان کردیم.
درجه حرارت نگهداری اسپرم ها بر میزان ATP سلول های مذکور تاثیرگذار خواهد بود. لذا جهت بررسی دمای مناسب نگهداری ، اسپرم ها به مدت ۶ ساعت در دمای ۴ درجه و دمای آزمایشگاه نگهداری و سپس میزان ATP آن ها مورد اندازه گیری قرار گرفت. معمولا برای نگهداری اسپرم از محلول های تداوم بخشExtenders )) استفاده می کنند این محلول ها سبب تداوم و حفظ فعالیت اسپرم ها در دوره نگهداری می شوند. به منظور بررسی بهترین محلول تداوم بخش ، محلول گلیسرول ۱۰ درصد و گلوکز ۰.۳ مولار ، محلول نمک ۰.۷ درصد و محلول نمک ۰.۶۵ درصد مورد بررسی قرار گرفتند . میزان ATP اسپرم ها در محلول های مذکور پس از نگهداری اسپرم در دمای منفی ۱۵ درجه در زمان های ۵ و ۱۰ روز مورد سنجش قرار گرفت.
جهت انجام تحقیق در روز دهم آبان ۱۳۸۴از دریاچه خزر که دمای آب آن ۱۸ تا ۲۰?C و شوری آن ۱۲ تا ۱۳ ppm بود و همچنین در روز ۱۷ آبان ۱۳۸۴ در پی کولاک و کاهش چشمگیردمای هوا از دریاچه خزرکه دمای آب آن ۱۰ تا ۱۲ ?C و شوری آن ۱۲ تا ppm 13
بحث و نتیجه گیری
تحقیقات زیادی در ارتباط با اسپرم ماهی در جهان صورت گرفته است که هر کدام جنبه خاصی را مد نظر قرار داده است. محدودیت ها و مشکلات و عوامل موجب خطا به صورت زیر است : یکی از مشکلات و محدودیت های این پروژه، محدودیت زمانی بود زیرا این پروژه باید در طول فصل تولید مثل ماهی کفال طلایی که دو ماه می باشد انجام می شد هم چنین به علت بروز مشکلات غیرمترقبه در زمان انجام این پروژه ، به اواسط فصل تولیدمثل نزدیک شده در نتیجه اندازه گیری میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی در دوره های نگهداری کوتاه مدت ۵ و ۱۰ روزه انجام شد که در صورت عدم وجود این محدودیت های زمانی ، اندازه گیری میزان ATP اسپرم درحا اطلاعات محدودی در مورد میزان ATP اسپرم ماهی و اثرات فاکتورهای محیطی و شیمیایی و بیوشیمیایی بر آن وجود دارد.
طبق گزارشات Perchec و همکارانش(۱۰ ) در صورت آلوده نشدن اسپرم به ادرار، میزان ATP آن حدود اسپرم و در صورت آلوده شدن به ادرار، میزان ATP آن حدود اسپرم بود. برای اندازه گیری غلظت ATP، لوسیفرین – لوسیفر از ( حل شده در ۱۰۰mM گلایسین، ۲۰mM Mgso4، PH7/4) را به نمونه افزوده وسیگنالهای بیولومینوسانس را با استفاده از یک دستگاه
لومینومتر Lmax ، ۹۶ چاهکی (Molecular Devices Sunngvale CA USA) اندازه گیری می کنند و میزان ATP هر نمونه را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه می کنند
و بصورت Pmol/108 اسپرم بیان می شود.Ogier وهمکارانش(۱۱)
میزان ATP را با استفاده از روش بیولومینوسانس(اندازه گیری بیولومینوسانس
Kit ClsII ATP ،Boehringer-Mannheim ) ، پس از استخراج با یک تری کلرواستیک اسید۲% ، mM2 EDTA، اندازه گیری کردند و بصورت nmol/108 اسپرم بیان کردند. Perchec و همکارانش (۱۰) میزان ATP را بوسیله روش بیولومینوسانس اندازه گیری کردند به این شکل که اسپرم ماهی کپور معمولی را به نسبت ۱۰۰/۱ در بافر HEPES جوشان تجزیه کرده و سپس با افزودن لوسیفرین – لوسیفراز به اسپرم، سیگنالهای لومینوسانس را به وسیله (Biocounter M2010A Lumac/3M) اندازه گیری کردند و سپس میزان ATP را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه کردن و بصورت nmol/108 اسپرم بیان کرده اند. در مورد تلقیح مصنوعی گاهی نگهداری اسپرم لازم است . مدت زمان تحرک اسپرم نیز متاثر از دمای نگهداری است بطوریکه طبق گزارشات ۱۲)) نگهداری کوتاه مدت (۱۵ دقیقه) اسپرم در دمای ?C 20، مدت زمان تحرکش را کاهش می دهد، آنها همچنین مشاهده کردند که میزان تحرک اسپرم کپور ماهی معمولی پس از ۲ ساعت نگهداری در دمای ?C 20 حدود ۵۰% کاهش یافت. نتایج تحقیق این دو همکار نشان داد که امکان نگهداری اسپرم در یخچال (?C 5 ) تا ۲۴ ساعت برای ماهی کپور معمولی و تا ۸ ساعت برای ماهی کپور علفخوار بدون کاهش قابل توجه کیفیت اسپرم وجود دارد. در مورد ماهی قزل آلا Oncorhynchus mykiss ، گزارش شده است که سطح ATP و میزان حرکت اسپرم این نوع ماهی بعد از ذوب بطور قابل توجهی کاهش می یابد. ولی Ogier و همکارانش گزارش کردند که اسپرم گربه ماهی اروپایی بدون کاهش سطح ATP خیلی متفاوت عمل می کنند. اسپرم منجمد شده گربه ماهی اروپایی با DMA موجب افزایش قابل توجه سطح ATP اسپرم می شود که این بدین علت است که DMA موجب تحریک مستقیم سنتز ATP می شود که این افزایش سطح ATP در طول فرآیند، احتمالاً یک عامل مهم در تحمل انجماد اسپرم گربه ماهی اروپایی در حالت وجود DMA باشد. ولی نتایج کسب شده از آزمایشات به ما نشان داد که در این تحقیق بهترین تداوم بخش گلیسرول ۱۰% و گلوکز ۳M/0 است. ضمنا تحقیق مشابهی در این رابطه یافت نشده است.
